El neuroblastoma es un tipo de tumor sólido pediátrico que conlleva un mal pronóstico, sobre todo en pacientes de alto riesgo, que son la mayoría. Uno de los principales obstáculos en el tratamiento de este y otros tumores sólidos es la matriz extracelular (MEC) densa y aberrante presente en microambiente tumoral (TME), que limita la difusión de fármacos y la infiltración de células inmunes. Este trabajo explora un novedoso enfoque nanotecnológico para mejorar tanto la penetración como la actividad citotóxica de las células inmunitarias dentro de los tumores de neuroblastoma. La estrategia se basa en la incorporación de nanocápsulas poliméricas enzimáticas en la superficie de macrófagos mediante su fusión con liposomas que las contienen en su superficie. Estas nanocápsulas contuvieron tres enzimas diferentes: colagenasa (NC Col), hialuronidasa (NC Hyal) y peroxidasa (NC HRP). NC-Col y NC-Hyal se diseñaron con recubrimientos poliméricos sensibles al pH, permitiendo la liberación de las enzimas en el TME ligeramente ácido, mientras que NC-HRP era no degradable, lo que permitió la infiltración de su sustrato a lo largo de la cápsula.
Las nanocápsulas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS), confirmando su morfología esférica, su tamaño adecuado y la encapsulación exitosa. Los liposomas se funcionalizaron con elementos de targeting (carboxi-D manosa o 1-(4- Aminobencil)guanidina) y diferentes nanocápsulas mediante química de carbodiimidas, integrando estos nanomateriales en un nanosistema complejo. Los ensayos enzimáticos confirmaron que los liposomas con las enzimas encapsuladas conservaban la actividad, aunque a niveles reducidos en comparación con las formas nativas, lo que sugiere su uso adecuado para aplicaciones terapéuticas.
Los experimentos de co-cultivo in vitro demostraron que los macrófagos fusionados con liposomas con NC HRP y NC Col, aumentaban significativamente su citotoxicidad contra células LAN-1 de neuroblastoma en presencia de ácido indolacético (IAA). En modelos de MEC como son los geles de colágeno y geles mixtos de colágeno y ácido hialurónico, los nanosistemas mostraron capacidad de degradación, con mayor acción cuando se combinaron colagenasa e hialuronidasa, lo que indica un efecto sinérgico. Sin embargo, la migración de macrófagos modificados a través de hidrogeles de colágeno siguió siendo limitada, lo que sugiere la necesidad de estímulos quimiotácticos adicionales para facilitar una infiltración eficaz en ambientes de MEC complejos.
ABSTRACT
Neuroblastoma is a pediatric solid tumor which involves a poor prognosis, particularly in high-risk patients, that are the majority. One of the main obstacles in the treatment of this and other solid tumors is the dense and aberrant extracellular matrix (MEC) within the tumor microenvironment (TME), which limits drug diffusion and immune cell infiltration. This work explores a novel nanotechnological approach to enhance both the penetration and cytotoxic activity of immune cells within neuroblastoma tumors. The strategy is based on the addition of enzymatic polymeric nanocapsules on the surface of macrophages by their fusion with liposomes that contain them in their surface. These nanocapsules contained three different enzymes: collagenase (NC Col), hyaluronidase (NC Hyal), and peroxidase (NC HRP). NC-Col and NC-Hyal were designed with pH-sensitive polymer coatings, enabling the release of enzymes in the slightly acidic TME, while NC-HRP was non-degradable, allowing the infiltration of its substrate along the coating.
Nanocapsules were characterized by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS), confirming spherical morphology, appropriate size distribution, and successful enzyme encapsulation. Liposomes were functionalized with targeting elements (carboxy-D mannose or 1-(4- Aminobencil)guanidine) and different nanocapsules using carbodiimide chemistry, integrating these nanomaterials into a complex nanosystem. Enzymatic assays confirmed that liposomes with the encapsulated enzymes retained activity, although at reduced levels compared to native forms, suggesting their use suitable for therapeutic applications.
In vitro co-culture experiments demonstrated that macrophages fused with liposomes with NC HRP and NC Col, significantly increased cytotoxicity against LAN-1 neuroblastoma cells in the presence of indoleacetic acid (IAA). In MEC models as collagen and mixed collagen–hyaluronic acid gels, nanosystems exhibited degrading capacity, with better action when collagenase and hyaluronidase were combined, indicating a synergistic effect. However, the migration of modified macrophages through collagen hydrogels remained limited, suggesting the need for additional chemotactic stimuli to facilitate effective infiltration in complex ECM environments.
El neuroblastoma es un tipo de tumor sólido pediátrico que conlleva un mal pronóstico, sobre todo en pacientes de alto riesgo, que son la mayoría. Uno de los principales obstáculos en el tratamiento de este y otros tumores sólidos es la matriz extracelular (MEC) densa y aberrante presente en microambiente tumoral (TME), que limita la difusión de fármacos y la infiltración de células inmunes. Este trabajo explora un novedoso enfoque nanotecnológico para mejorar tanto la penetración como la actividad citotóxica de las células inmunitarias dentro de los tumores de neuroblastoma. La estrategia se basa en la incorporación de nanocápsulas poliméricas enzimáticas en la superficie de macrófagos mediante su fusión con liposomas que las contienen en su superficie. Estas nanocápsulas contuvieron tres enzimas diferentes: colagenasa (NC Col), hialuronidasa (NC Hyal) y peroxidasa (NC HRP). NC-Col y NC-Hyal se diseñaron con recubrimientos poliméricos sensibles al pH, permitiendo la liberación de las enzimas en el TME ligeramente ácido, mientras que NC-HRP era no degradable, lo que permitió la infiltración de su sustrato a lo largo de la cápsula.
Las nanocápsulas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS), confirmando su morfología esférica, su tamaño adecuado y la encapsulación exitosa. Los liposomas se funcionalizaron con elementos de targeting (carboxi-D manosa o 1-(4- Aminobencil)guanidina) y diferentes nanocápsulas mediante química de carbodiimidas, integrando estos nanomateriales en un nanosistema complejo. Los ensayos enzimáticos confirmaron que los liposomas con las enzimas encapsuladas conservaban la actividad, aunque a niveles reducidos en comparación con las formas nativas, lo que sugiere su uso adecuado para aplicaciones terapéuticas.
Los experimentos de co-cultivo in vitro demostraron que los macrófagos fusionados con liposomas con NC HRP y NC Col, aumentaban significativamente su citotoxicidad contra células LAN-1 de neuroblastoma en presencia de ácido indolacético (IAA). En modelos de MEC como son los geles de colágeno y geles mixtos de colágeno y ácido hialurónico, los nanosistemas mostraron capacidad de degradación, con mayor acción cuando se combinaron colagenasa e hialuronidasa, lo que indica un efecto sinérgico. Sin embargo, la migración de macrófagos modificados a través de hidrogeles de colágeno siguió siendo limitada, lo que sugiere la necesidad de estímulos quimiotácticos adicionales para facilitar una infiltración eficaz en ambientes de MEC complejos.
ABSTRACT
Neuroblastoma is a pediatric solid tumor which involves a poor prognosis, particularly in high-risk patients, that are the majority. One of the main obstacles in the treatment of this and other solid tumors is the dense and aberrant extracellular matrix (MEC) within the tumor microenvironment (TME), which limits drug diffusion and immune cell infiltration. This work explores a novel nanotechnological approach to enhance both the penetration and cytotoxic activity of immune cells within neuroblastoma tumors. The strategy is based on the addition of enzymatic polymeric nanocapsules on the surface of macrophages by their fusion with liposomes that contain them in their surface. These nanocapsules contained three different enzymes: collagenase (NC Col), hyaluronidase (NC Hyal), and peroxidase (NC HRP). NC-Col and NC-Hyal were designed with pH-sensitive polymer coatings, enabling the release of enzymes in the slightly acidic TME, while NC-HRP was non-degradable, allowing the infiltration of its substrate along the coating.
Nanocapsules were characterized by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS), confirming spherical morphology, appropriate size distribution, and successful enzyme encapsulation. Liposomes were functionalized with targeting elements (carboxy-D mannose or 1-(4- Aminobencil)guanidine) and different nanocapsules using carbodiimide chemistry, integrating these nanomaterials into a complex nanosystem. Enzymatic assays confirmed that liposomes with the encapsulated enzymes retained activity, although at reduced levels compared to native forms, suggesting their use suitable for therapeutic applications.
In vitro co-culture experiments demonstrated that macrophages fused with liposomes with NC HRP and NC Col, significantly increased cytotoxicity against LAN-1 neuroblastoma cells in the presence of indoleacetic acid (IAA). In MEC models as collagen and mixed collagen–hyaluronic acid gels, nanosystems exhibited degrading capacity, with better action when collagenase and hyaluronidase were combined, indicating a synergistic effect. However, the migration of modified macrophages through collagen hydrogels remained limited, suggesting the need for additional chemotactic stimuli to facilitate effective infiltration in complex ECM environments. Read More
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