La comunicación bidireccional gestada entre el embrión temprano y el entorno oviductal involucra la participación de vesículas extracelulares (EVs) como intermediarias de este fino diálogo, permitiendo el establecimiento de eventos fisiológicos necesarios para la preñez y su mantenimiento. Para lograr comprender esta interacción se han desarrollado modelos in vitro que tratan de replicar las condiciones in vivo, es por ello que el objetivo de este estudio fue dilucidar cuál es la función biológica de las EVs favoreciendo la comunicación bidireccional materno-embrionaria y cómo pueden influir en el desarrollo embrionario preimplantacional, a través del análisis de su carga de RNA. Se usó un modelo de co-cultivo de embriones de 8-16 células con una monocapa de células epiteliales de oviducto bovino (BOEC). Las EVs se aislaron (por cromatografía de exclusión por tamaño) y caracterizaron de cuatro grupos experimentales: grupo control de medio SOF+5%dFCS (Control), grupo de monocapa de BOEC (EV_BOEC), grupo de embriones 8-16 células (EV_EMB) y grupo co-cultivo de BOEC con embriones de 8-16 células (EV_E+B). Luego, se aisló la carga total de RNA de las EVs, y se remitieron las muestras para análisis de calidad y secuenciación de miRNA. El desarrollo embrionario se evaluó en base al porcentaje de embriones que alcanzaron la etapa de 8 -16 células a las 54 y 96 hpi respectivamente. Las tasas de desarrollo embrionario totales evaluadas a las 54 hpi fueron del 85.2% con una proporción de embriones que alcanzaron el desarrollo de 8 células del 60.8%. Hubo una diferencia significativa (P < 0.001) del desarrollo evaluado a las 96 hpi (>16 células) de aquellos embriones que se co-cultivaron con BOEC (76.0%) versus los embriones cultivados individualmente (34.0%). Se comprobó una concentración nula de EVs en el grupo control que correspondía con las bajas concentraciones de RNA en este mismo grupo, descartando el posible sesgo generado por los medios condicionados. No hubo diferencia significativa (P>0.05) entre las concentraciones de EVs de los tres grupos experimentales restantes. Usando un bioanalizador se comprobó que las muestras de RNA tenían la calidad e integridad necesarias para continuar por los procesos posteriores de secuenciación. Por lo tanto, se concluye que las EVs derivadas de un sistema in vitro de co-cultivo entre embriones y monocapa de BOEC ejercen un efecto bidireccional positivo, gracias a su carga molecular, sobre ambos grupos celulares en favor del desarrollo embrionario.
ABSTRACT
The bidirectional communication established between the early embryo and the oviductal environment involves the participation of extracellular vesicles (EVs) as intermediaries in this delicate dialogue, enabling the establishment of physiological events necessary for pregnancy and its maintenance. To better understand this interaction, in vitro models have been developed to replicate in vivo conditions. Therefore, the objective of this study was to elucidate the biological function of EVs in facilitating maternal-embryonic bidirectional communication in bovine and how they may influence preimplantation embryonic development, through the analysis of their RNA cargo. A co-culture model of 8-16 cell stage embryos with a monolayer of bovine oviductal epithelial cells (BOEC) was used. EVs were isolated by size exclusion chromatography and characterized from four experimental groups: control group with SOF medium + 5% FCS (Control), BOEC monolayer group (EV-BOEC), 8-16 cell embryo group (EV-EMB), and the BOEC co-culture with 8-16 cell embryos group (EV_E+B). Subsequently, the total RNA cargo of the EVs was isolated, and the samples were submitted for quality analysis and miRNA sequencing. Embryonic development was assessed based on the percentage of embryos reaching the 8-16 cell stage at 54 and 96 hpi, respectively. The overall embryonic developmental rates at 54 hpi were 85.2%, with 60.8% of embryos reaching the 8-cell stage. There was a significant increase (P> 0.001) in development assessed at 96 hpi (>16 cells) between embryos co-cultured with BOEC (76.0%) versus embryos cultured individually (34.0%). A negligible concentration of EVs was detected in the control group, corresponding to the low RNA concentrations in this group, thus ruling out potential bias from conditioned media. No significant difference was found in EVs concentrations among the remaining three experimental groups. Using a bioanalyzer, it was confirmed that the RNA staples had the necessary quality and integrity for further sequencing processes. Therefore, it is concluded that EVs derived from an in vitro co-culture system between embryos and a BOEC monolayer exert a positive bidirectional effect, due to their molecular cargo, favoring embryonic development.
La comunicación bidireccional gestada entre el embrión temprano y el entorno oviductal involucra la participación de vesículas extracelulares (EVs) como intermediarias de este fino diálogo, permitiendo el establecimiento de eventos fisiológicos necesarios para la preñez y su mantenimiento. Para lograr comprender esta interacción se han desarrollado modelos in vitro que tratan de replicar las condiciones in vivo, es por ello que el objetivo de este estudio fue dilucidar cuál es la función biológica de las EVs favoreciendo la comunicación bidireccional materno-embrionaria y cómo pueden influir en el desarrollo embrionario preimplantacional, a través del análisis de su carga de RNA. Se usó un modelo de co-cultivo de embriones de 8-16 células con una monocapa de células epiteliales de oviducto bovino (BOEC). Las EVs se aislaron (por cromatografía de exclusión por tamaño) y caracterizaron de cuatro grupos experimentales: grupo control de medio SOF+5%dFCS (Control), grupo de monocapa de BOEC (EV_BOEC), grupo de embriones 8-16 células (EV_EMB) y grupo co-cultivo de BOEC con embriones de 8-16 células (EV_E+B). Luego, se aisló la carga total de RNA de las EVs, y se remitieron las muestras para análisis de calidad y secuenciación de miRNA. El desarrollo embrionario se evaluó en base al porcentaje de embriones que alcanzaron la etapa de 8 -16 células a las 54 y 96 hpi respectivamente. Las tasas de desarrollo embrionario totales evaluadas a las 54 hpi fueron del 85.2% con una proporción de embriones que alcanzaron el desarrollo de 8 células del 60.8%. Hubo una diferencia significativa (P < 0.001) del desarrollo evaluado a las 96 hpi (>16 células) de aquellos embriones que se co-cultivaron con BOEC (76.0%) versus los embriones cultivados individualmente (34.0%). Se comprobó una concentración nula de EVs en el grupo control que correspondía con las bajas concentraciones de RNA en este mismo grupo, descartando el posible sesgo generado por los medios condicionados. No hubo diferencia significativa (P>0.05) entre las concentraciones de EVs de los tres grupos experimentales restantes. Usando un bioanalizador se comprobó que las muestras de RNA tenían la calidad e integridad necesarias para continuar por los procesos posteriores de secuenciación. Por lo tanto, se concluye que las EVs derivadas de un sistema in vitro de co-cultivo entre embriones y monocapa de BOEC ejercen un efecto bidireccional positivo, gracias a su carga molecular, sobre ambos grupos celulares en favor del desarrollo embrionario.
ABSTRACT
The bidirectional communication established between the early embryo and the oviductal environment involves the participation of extracellular vesicles (EVs) as intermediaries in this delicate dialogue, enabling the establishment of physiological events necessary for pregnancy and its maintenance. To better understand this interaction, in vitro models have been developed to replicate in vivo conditions. Therefore, the objective of this study was to elucidate the biological function of EVs in facilitating maternal-embryonic bidirectional communication in bovine and how they may influence preimplantation embryonic development, through the analysis of their RNA cargo. A co-culture model of 8-16 cell stage embryos with a monolayer of bovine oviductal epithelial cells (BOEC) was used. EVs were isolated by size exclusion chromatography and characterized from four experimental groups: control group with SOF medium + 5% FCS (Control), BOEC monolayer group (EV-BOEC), 8-16 cell embryo group (EV-EMB), and the BOEC co-culture with 8-16 cell embryos group (EV_E+B). Subsequently, the total RNA cargo of the EVs was isolated, and the samples were submitted for quality analysis and miRNA sequencing. Embryonic development was assessed based on the percentage of embryos reaching the 8-16 cell stage at 54 and 96 hpi, respectively. The overall embryonic developmental rates at 54 hpi were 85.2%, with 60.8% of embryos reaching the 8-cell stage. There was a significant increase (P> 0.001) in development assessed at 96 hpi (>16 cells) between embryos co-cultured with BOEC (76.0%) versus embryos cultured individually (34.0%). A negligible concentration of EVs was detected in the control group, corresponding to the low RNA concentrations in this group, thus ruling out potential bias from conditioned media. No significant difference was found in EVs concentrations among the remaining three experimental groups. Using a bioanalyzer, it was confirmed that the RNA staples had the necessary quality and integrity for further sequencing processes. Therefore, it is concluded that EVs derived from an in vitro co-culture system between embryos and a BOEC monolayer exert a positive bidirectional effect, due to their molecular cargo, favoring embryonic development. Read More
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