El asma es una de las enfermedades crónicas más comunes que afectan a la población mundial. Su incidencia y prevalencia han aumentado en los últimos años y se prevé un crecimiento aún mayor en un futuro próximo. Los tratamientos actuales se centran en aliviar los síntomas, en lugar de abordar el origen de la enfermedad. Como alternativa, se están desarrollando terapias novedosas dirigidas a inhibir o reducir la actividad de las moléculas responsables del asma.
En este trabajo, se presenta una posible terapia inmunomoduladora para el tratamiento del asma crónico. La terapia propuesta consiste en la producción de una proteína quimérica, resultado de la fusión de los dominios de unión de CRTH2 (bdCRTH2), el receptor de prostaglandina D2 (PGD2), con VP1, la proteína mayor de la cápside del norovirus. Esta construcción es capaz de autoensamblarse en partículas similares a virus (virus-like particles) basadas en la estructura del norovirus. La finalidad de esta terapia es secuestrar de manera eficiente PGD2, mediador inflamatorio responsable de la exacerbación y cronificación del asma. El objetivo central de este estudio es la caracterización de la proteína quimérica, denominada Monster.
En primer lugar, los análisis in silico confirmaron la viabilidad de la modificación de la proteína de fusión (bdCRTH2-VP1). Tras su producción en Pichia pastoris, Monster fue purificado mediante cromatografía de exclusión molecular y su identidad fue confirmada mediante inmunodetección. Para evaluar el ensamblaje, la integridad y el correcto plegamiento de las partículas, se realizaron análisis mediante Dispersión Dinámica de Luz (DLS) y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). Estos análisis revelaron una población homogénea de partículas icosaédricas completamente ensambladas, que mostraban CRTH2 en su superficie, lo que confirmó la obtención exitosa de la construcción final Monster. El siguiente paso consistió en su caracterización.
El análisis funcional incluyó la evaluación de la capacidad de unión de Monster por PGD2. Se observó un Kd comparable al del receptor nativo CRTH2 humano, con valores de 1.5 nM y 2.5 nM, respectivamente. Posteriormente, la caracterización celular permitió identificar el perfil inmunogénico de Monster. Altas cantidades indujeron la producción de NF-κB y modificaron la supervivencia celular; sin embargo, cantidades más bajas permanecieron inmunológicamente indetectables, lo que sugiere la cantidad óptima para futuras aplicaciones terapéuticas.
Un paso fundamental en la caracterización de nuevas terapias es el análisis de su perfil farmacocinético, en relación con su absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME). Para ello, se evaluó la absorción mediante tres modelos epiteliales distintos en un sistema de cultivo Transwell: monocapas de piel, epitelio pulmonar y gastrointestinal. Monster fue capaz de atravesar los epitelios pulmonar y gastrointestinal simulados, lo que los sugiere como vías de administración favorables.
Finalmente, Monster fue evaluado in vivo. La sensibilización y el challenge en un modelo murino no provocaron reacciones adversas, lo que demuestra un perfil de seguridad adecuado. La hepatotoxicidad se evaluó mediante la detección de galectina-3 en tejido hepático, y la ausencia de su expresión confirmó inexistencia de efectos tóxicos. Estos resultados refuerzan el perfil de seguridad de Monster y destacan su potencial como futura terapia inmunomoduladora.
Los próximos pasos en este proyecto deberían incluir la simulación in vitro de un modelo pulmonar para evaluar la capacidad de Monster de secuestrar PGD2. Posteriormente, la utilización de un modelo murino alérgico permitiría evaluar su eficacia, explorar diversas rutas de administración y confirmar los resultados de permeabilidad observados in vitro.
ABSTRACT
Asthma is one of the most frequent chronic diseases affecting the global population. Its incidence and prevalence have increased in recent years, with further growth expected soon. Current treatments mainly focus on alleviating symptoms, rather than addressing the source of the disease. As an alternative to conventional treatments, novel therapies are being developed, targeting the molecules responsible for asthma.
This work presents an immunomodulatory therapy for the treatment of chronic allergic asthma, focusing on the exacerbations and chronification. The proposed therapy involves the fusion of the binding domains of CRTH2 (bdCRTH2), the prostaglandin D2 receptor, to VP1, de major capsid protein of norovirus. These constructs can self-assemble into virus-like particles based on norovirus´ structure. The principal aim of this therapy is to efficiently sequester PGD2, the inflammatory mediator responsible for the exacerbation and chronification of asthma. The main objective of this study is the characterisation of the chimeric protein, referred to as Monster.
Firstly, in silico analysis confirmed viability of VP1 protein modification. After production in Pichia pastoris, Monster was purified through size-exclusion chromatography, and identity confirmation was achieved after immunodetection. In order to evaluate the assembly, integrity and folding of the particles, Dynamic Light Scattering and Transmission Electron Microscopy were performed. These analyses revealed a homogenous population of fully assembled icosahedral particles that displayed CRTH2 on the exterior, resulting in the successful final Monster construct. The next step involved its characterisation.
Functional analysis included evaluation of Monster´s affinity for PGD2. It exhibited a Kd similar to that of the native human CRTH2 receptor, of 1.2 nM and 2.5 nM respectively. After this, cellular characterisation disclosed the immunogenic profile of Monster. Higher quantities induced NF-κB production and modified cell survival, however, lower quantities remained immunologically undetected, indicating the optimal amount for the future therapeutical applications.
A fundamental step for the characterisation of novel formulas is the analysis of their pharmacokinetic profile, related to absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME). For this matter, absorption was tested through three distinct epithelia models in a Transwell system: skin, pulmonary and gastrointestinal monolayers. Monster was able to transport across the simulated pulmonary and gastrointestinal epithelia, suggesting favourable routes for administration.
Finally, Monster was evaluated in vivo. Sensitisation and challenge with Monster in a mice model did not elicit any adverse reactions, demonstrating an appropriate safety profile. Hepatotoxicity was assessed by galectin-3 detection in the liver, and the absence of galectin-3 expression indicated no toxic effects. These findings reinforce Monster´s safety and highlight its potential as a future immunomodulatory therapy. Further steps in this project should include the in vitro simulation of lung model to test Monster´s ability to sequester PGD2. Subsequent in vivo allergic mice model could evaluate Monster´s efficacy, as well test diverse administration routes and confirm the in vitro permeability results.
El asma es una de las enfermedades crónicas más comunes que afectan a la población mundial. Su incidencia y prevalencia han aumentado en los últimos años y se prevé un crecimiento aún mayor en un futuro próximo. Los tratamientos actuales se centran en aliviar los síntomas, en lugar de abordar el origen de la enfermedad. Como alternativa, se están desarrollando terapias novedosas dirigidas a inhibir o reducir la actividad de las moléculas responsables del asma.
En este trabajo, se presenta una posible terapia inmunomoduladora para el tratamiento del asma crónico. La terapia propuesta consiste en la producción de una proteína quimérica, resultado de la fusión de los dominios de unión de CRTH2 (bdCRTH2), el receptor de prostaglandina D2 (PGD2), con VP1, la proteína mayor de la cápside del norovirus. Esta construcción es capaz de autoensamblarse en partículas similares a virus (virus-like particles) basadas en la estructura del norovirus. La finalidad de esta terapia es secuestrar de manera eficiente PGD2, mediador inflamatorio responsable de la exacerbación y cronificación del asma. El objetivo central de este estudio es la caracterización de la proteína quimérica, denominada Monster.
En primer lugar, los análisis in silico confirmaron la viabilidad de la modificación de la proteína de fusión (bdCRTH2-VP1). Tras su producción en Pichia pastoris, Monster fue purificado mediante cromatografía de exclusión molecular y su identidad fue confirmada mediante inmunodetección. Para evaluar el ensamblaje, la integridad y el correcto plegamiento de las partículas, se realizaron análisis mediante Dispersión Dinámica de Luz (DLS) y Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). Estos análisis revelaron una población homogénea de partículas icosaédricas completamente ensambladas, que mostraban CRTH2 en su superficie, lo que confirmó la obtención exitosa de la construcción final Monster. El siguiente paso consistió en su caracterización.
El análisis funcional incluyó la evaluación de la capacidad de unión de Monster por PGD2. Se observó un Kd comparable al del receptor nativo CRTH2 humano, con valores de 1.5 nM y 2.5 nM, respectivamente. Posteriormente, la caracterización celular permitió identificar el perfil inmunogénico de Monster. Altas cantidades indujeron la producción de NF-κB y modificaron la supervivencia celular; sin embargo, cantidades más bajas permanecieron inmunológicamente indetectables, lo que sugiere la cantidad óptima para futuras aplicaciones terapéuticas.
Un paso fundamental en la caracterización de nuevas terapias es el análisis de su perfil farmacocinético, en relación con su absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME). Para ello, se evaluó la absorción mediante tres modelos epiteliales distintos en un sistema de cultivo Transwell: monocapas de piel, epitelio pulmonar y gastrointestinal. Monster fue capaz de atravesar los epitelios pulmonar y gastrointestinal simulados, lo que los sugiere como vías de administración favorables.
Finalmente, Monster fue evaluado in vivo. La sensibilización y el challenge en un modelo murino no provocaron reacciones adversas, lo que demuestra un perfil de seguridad adecuado. La hepatotoxicidad se evaluó mediante la detección de galectina-3 en tejido hepático, y la ausencia de su expresión confirmó inexistencia de efectos tóxicos. Estos resultados refuerzan el perfil de seguridad de Monster y destacan su potencial como futura terapia inmunomoduladora.
Los próximos pasos en este proyecto deberían incluir la simulación in vitro de un modelo pulmonar para evaluar la capacidad de Monster de secuestrar PGD2. Posteriormente, la utilización de un modelo murino alérgico permitiría evaluar su eficacia, explorar diversas rutas de administración y confirmar los resultados de permeabilidad observados in vitro.
ABSTRACT
Asthma is one of the most frequent chronic diseases affecting the global population. Its incidence and prevalence have increased in recent years, with further growth expected soon. Current treatments mainly focus on alleviating symptoms, rather than addressing the source of the disease. As an alternative to conventional treatments, novel therapies are being developed, targeting the molecules responsible for asthma.
This work presents an immunomodulatory therapy for the treatment of chronic allergic asthma, focusing on the exacerbations and chronification. The proposed therapy involves the fusion of the binding domains of CRTH2 (bdCRTH2), the prostaglandin D2 receptor, to VP1, de major capsid protein of norovirus. These constructs can self-assemble into virus-like particles based on norovirus´ structure. The principal aim of this therapy is to efficiently sequester PGD2, the inflammatory mediator responsible for the exacerbation and chronification of asthma. The main objective of this study is the characterisation of the chimeric protein, referred to as Monster.
Firstly, in silico analysis confirmed viability of VP1 protein modification. After production in Pichia pastoris, Monster was purified through size-exclusion chromatography, and identity confirmation was achieved after immunodetection. In order to evaluate the assembly, integrity and folding of the particles, Dynamic Light Scattering and Transmission Electron Microscopy were performed. These analyses revealed a homogenous population of fully assembled icosahedral particles that displayed CRTH2 on the exterior, resulting in the successful final Monster construct. The next step involved its characterisation.
Functional analysis included evaluation of Monster´s affinity for PGD2. It exhibited a Kd similar to that of the native human CRTH2 receptor, of 1.2 nM and 2.5 nM respectively. After this, cellular characterisation disclosed the immunogenic profile of Monster. Higher quantities induced NF-κB production and modified cell survival, however, lower quantities remained immunologically undetected, indicating the optimal amount for the future therapeutical applications.
A fundamental step for the characterisation of novel formulas is the analysis of their pharmacokinetic profile, related to absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME). For this matter, absorption was tested through three distinct epithelia models in a Transwell system: skin, pulmonary and gastrointestinal monolayers. Monster was able to transport across the simulated pulmonary and gastrointestinal epithelia, suggesting favourable routes for administration.
Finally, Monster was evaluated in vivo. Sensitisation and challenge with Monster in a mice model did not elicit any adverse reactions, demonstrating an appropriate safety profile. Hepatotoxicity was assessed by galectin-3 detection in the liver, and the absence of galectin-3 expression indicated no toxic effects. These findings reinforce Monster´s safety and highlight its potential as a future immunomodulatory therapy. Further steps in this project should include the in vitro simulation of lung model to test Monster´s ability to sequester PGD2. Subsequent in vivo allergic mice model could evaluate Monster´s efficacy, as well test diverse administration routes and confirm the in vitro permeability results. Read More
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