The idea that mutations can affect many traits simultaneously (pleiotropy) has long intrigued evolutionary biologists due to its paradoxical role in adaptation. On one hand, pleiotropic mutations are expected to be disfavoured: even if beneficial for one trait, their chance effects on others are often deleterious, reducing fitness in both local and secondary environments. On the other hand, experiments have shown that mildly pleiotropic mutations can drive early adaptation to novel environments, and theory predicts they may be favoured when populations are far from their fitness optimum or face simultaneous selection on multiple traits. Despite this importance, the magnitude, direction, and long-term consequences of pleiotropy in microbial adaptation remain poorly understood. To address this, we conducted laboratory evolution experiments examining how adaptation to antibiotics and environmental pollutants reshapes virulence-related traits and mutational sensitivity in Escherichia coli, Serratia marcescens, and Proteus mirabilis.
Using a well-established E. coli uropathogenic model, we showed that adaptation to diverse antibiotic classes rapidly produced drug-specific pleiotropic effects on traits such as motility, biofilm formation, and stress resistance. Whole-genome sequencing revealed both convergent and divergent mutations, often in global regulators, underscoring the complexity of pleiotropy in shaping bacterial phenotypes. In murine infection models, most resistant clones showed impaired in vivo performance across body sites, regardless of whether individual virulence traits were up- or downregulated, highlighting the clinical relevance of pleiotropic costs.
We next asked whether environmental complexity promotes pleiotropic adaptation by evolving S. marcescens in single, double, and triple combinations of three agricultural pollutants: naphthalene (hydrocarbon), paraquat (herbicide), and sodium nitrate (fertilizer). Although pollutant mixtures synergistically reduced survival, they did not promote systematically more pleiotropic mutations. Instead, collateral effects on antibiotic susceptibility and virulence varied widely and showed poor repeatability, even within treatments indicating that predicting cross-resistance in natural settings requires detailed knowledge of individual pollutants rather than overall stress complexity.
To explore pleiotropy over longer timescales, we examined whether sustained adaptation mitigates mutational side-effects as populations approach global fitness peaks. Using rifampicin resistance in the E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE), we found that after 15,000 generations, the fitness cost of resistance in the selective environment had declined, consistent with evolved mutational robustness. However, pleiotropic costs in alternate environments increased, matching the robustness fragility trade-off predicted by control theory.
Finally, we investigated pleiotropy across deeper evolutionary divergence by comparing rifampicin resistance in the three Enterobacteriaceae species. Although mutational targets were broadly conserved, codon usage differences limited overlap in specific amino acid changes. Fitness and virulence effects were also poorly conserved, illustrating how epistasis and genomic background constrain compensatory evolution and shape the persistence of resistance.
Collectively, our work clarifies how pleiotropy influences the evolutionary trajectories of bacterial adaptation. We reveal both predictable patterns and idiosyncratic outcomes, with implications for managing antibiotic resistance, designing evolution-informed therapies, and anticipating microbial responses to environmental challenges. These results further support anti-virulence strategies as valuable complements or alternatives to antibiotics, potentially mitigating infection severity while limiting selective pressure for resistance evolution.
RESUMEN
La idea de que una mutación pueda afectar simultáneamente varios rasgos (pleiotropía) ha intrigado durante décadas a los biólogos evolutivos por su papel aparentemente paradójico en la adaptación. Aunque suelen considerarse desfavorables por sus efectos colaterales, mutaciones con pleiotropía moderada pueden facilitar la adaptación temprana a entornos nuevos, en especial cuando las poblaciones están lejos de su óptimo o bajo selección múltiple y simultánea. Sin embargo, aún se conoce poco sobre la magnitud, dirección y consecuencias de la pleiotropía en microbios. Para confrontar esta cuestión, realizamos experimentos de evolución en laboratorio con Escherichia coli, Serratia marcescens y Proteus mirabilis, analizando cómo la adaptación a antibióticos y contaminantes ambientales modifica rasgos de virulencia, sensibilidad mutacional y capacidad de persistencia bajo condiciones cambiantes.
En una cepa uropatógena de E. coli observamos que la adaptación a distintas clases de antibióticos generó rápidamente efectos pleiotrópicos sobre motilidad, formación de biofilm y resistencia al estrés. Estos trade-offs mostraron patrones específicos de cada fármaco y una repetibilidad solo moderada entre réplicas. La secuenciación genómica reveló mutaciones tanto convergentes como divergentes, a menudo en reguladores globales, subrayando la complejidad de la pleiotropía. En modelos murinos, la mayoría de los clones resistentes mostró un rendimiento in vivo reducido en varios órganos, independientemente del efecto observado sobre rasgos individuales de virulencia, reforzando la importancia clínica de estos costes colaterales.
También evaluamos si un entorno más complejo favorece la pleiotropía al evolucionar poblaciones de S. marcescens en combinaciones simples, dobles y triples de naftaleno, paraquat y nitrato sódico. Aunque las mezclas redujeron sinérgicamente la supervivencia, no promovieron más mutaciones pleiotrópicas. Por el contrario, los efectos secundarios sobre virulencia y resistencia a antibióticos resultaron muy variables y poco repetibles, incluso dentro de un mismo tratamiento, lo que indica que la biología particular de cada contaminante es más determinante que la complejidad ambiental global para anticipar patrones de resistencia cruzada en escenarios ecológicos reales.
Para explorar la pleiotropía en escalas evolutivas más largas estudiamos la resistencia a rifampicina en el Long-Term Evolution Experiment con E. coli, un modelo clásico de mutaciones con amplios efectos. Tras 15.000 generaciones, los costes en el ambiente selectivo habían disminuido, reflejando mayor robustez mutacional, mientras que los costes pleiotrópicos en otros entornos aumentaron, en concordancia con el compromiso entre robustez y fragilidad predicho por la teoría del control de sistemas.
Finalmente, comparamos los efectos de la resistencia a rifampicina en E. coli, P. mirabilis y S. marcescens. Aunque varios sitios mutacionales se conservaron, las diferencias en uso de codones limitaron la coincidencia aminoacídica. Los efectos sobre aptitud y virulencia fueron escasamente conservados, lo que resalta el papel de la epistasis, del trasfondo genómico y de las interacciones compensatorias en la persistencia de la resistencia a lo largo del tiempo evolutivo.
En conjunto, nuestros resultados muestran cómo la pleiotropía puede moldear trayectorias evolutivas bacterianas de manera tanto predecible como contingente. Estas conclusiones tienen implicaciones amplias para afrontar la resistencia a antibióticos, diseñar terapias informadas por evolución y anticipar respuestas microbianas ante desafíos ambientales. Asimismo, apoyan el potencial de las estrategias antivirulencia como complemento o alternativa a los antibióticos, con capacidad de reducir la gravedad de las infecciones y de minimizar la presión selectiva que alimenta la propagación de la resistencia.
The idea that mutations can affect many traits simultaneously (pleiotropy) has long intrigued evolutionary biologists due to its paradoxical role in adaptation. On one hand, pleiotropic mutations are expected to be disfavoured: even if beneficial for one trait, their chance effects on others are often deleterious, reducing fitness in both local and secondary environments. On the other hand, experiments have shown that mildly pleiotropic mutations can drive early adaptation to novel environments, and theory predicts they may be favoured when populations are far from their fitness optimum or face simultaneous selection on multiple traits. Despite this importance, the magnitude, direction, and long-term consequences of pleiotropy in microbial adaptation remain poorly understood. To address this, we conducted laboratory evolution experiments examining how adaptation to antibiotics and environmental pollutants reshapes virulence-related traits and mutational sensitivity in Escherichia coli, Serratia marcescens, and Proteus mirabilis.
Using a well-established E. coli uropathogenic model, we showed that adaptation to diverse antibiotic classes rapidly produced drug-specific pleiotropic effects on traits such as motility, biofilm formation, and stress resistance. Whole-genome sequencing revealed both convergent and divergent mutations, often in global regulators, underscoring the complexity of pleiotropy in shaping bacterial phenotypes. In murine infection models, most resistant clones showed impaired in vivo performance across body sites, regardless of whether individual virulence traits were up- or downregulated, highlighting the clinical relevance of pleiotropic costs.
We next asked whether environmental complexity promotes pleiotropic adaptation by evolving S. marcescens in single, double, and triple combinations of three agricultural pollutants: naphthalene (hydrocarbon), paraquat (herbicide), and sodium nitrate (fertilizer). Although pollutant mixtures synergistically reduced survival, they did not promote systematically more pleiotropic mutations. Instead, collateral effects on antibiotic susceptibility and virulence varied widely and showed poor repeatability, even within treatments indicating that predicting cross-resistance in natural settings requires detailed knowledge of individual pollutants rather than overall stress complexity.
To explore pleiotropy over longer timescales, we examined whether sustained adaptation mitigates mutational side-effects as populations approach global fitness peaks. Using rifampicin resistance in the E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE), we found that after 15,000 generations, the fitness cost of resistance in the selective environment had declined, consistent with evolved mutational robustness. However, pleiotropic costs in alternate environments increased, matching the robustness fragility trade-off predicted by control theory.
Finally, we investigated pleiotropy across deeper evolutionary divergence by comparing rifampicin resistance in the three Enterobacteriaceae species. Although mutational targets were broadly conserved, codon usage differences limited overlap in specific amino acid changes. Fitness and virulence effects were also poorly conserved, illustrating how epistasis and genomic background constrain compensatory evolution and shape the persistence of resistance.
Collectively, our work clarifies how pleiotropy influences the evolutionary trajectories of bacterial adaptation. We reveal both predictable patterns and idiosyncratic outcomes, with implications for managing antibiotic resistance, designing evolution-informed therapies, and anticipating microbial responses to environmental challenges. These results further support anti-virulence strategies as valuable complements or alternatives to antibiotics, potentially mitigating infection severity while limiting selective pressure for resistance evolution.
RESUMEN
La idea de que una mutación pueda afectar simultáneamente varios rasgos (pleiotropía) ha intrigado durante décadas a los biólogos evolutivos por su papel aparentemente paradójico en la adaptación. Aunque suelen considerarse desfavorables por sus efectos colaterales, mutaciones con pleiotropía moderada pueden facilitar la adaptación temprana a entornos nuevos, en especial cuando las poblaciones están lejos de su óptimo o bajo selección múltiple y simultánea. Sin embargo, aún se conoce poco sobre la magnitud, dirección y consecuencias de la pleiotropía en microbios. Para confrontar esta cuestión, realizamos experimentos de evolución en laboratorio con Escherichia coli, Serratia marcescens y Proteus mirabilis, analizando cómo la adaptación a antibióticos y contaminantes ambientales modifica rasgos de virulencia, sensibilidad mutacional y capacidad de persistencia bajo condiciones cambiantes.
En una cepa uropatógena de E. coli observamos que la adaptación a distintas clases de antibióticos generó rápidamente efectos pleiotrópicos sobre motilidad, formación de biofilm y resistencia al estrés. Estos trade-offs mostraron patrones específicos de cada fármaco y una repetibilidad solo moderada entre réplicas. La secuenciación genómica reveló mutaciones tanto convergentes como divergentes, a menudo en reguladores globales, subrayando la complejidad de la pleiotropía. En modelos murinos, la mayoría de los clones resistentes mostró un rendimiento in vivo reducido en varios órganos, independientemente del efecto observado sobre rasgos individuales de virulencia, reforzando la importancia clínica de estos costes colaterales.
También evaluamos si un entorno más complejo favorece la pleiotropía al evolucionar poblaciones de S. marcescens en combinaciones simples, dobles y triples de naftaleno, paraquat y nitrato sódico. Aunque las mezclas redujeron sinérgicamente la supervivencia, no promovieron más mutaciones pleiotrópicas. Por el contrario, los efectos secundarios sobre virulencia y resistencia a antibióticos resultaron muy variables y poco repetibles, incluso dentro de un mismo tratamiento, lo que indica que la biología particular de cada contaminante es más determinante que la complejidad ambiental global para anticipar patrones de resistencia cruzada en escenarios ecológicos reales.
Para explorar la pleiotropía en escalas evolutivas más largas estudiamos la resistencia a rifampicina en el Long-Term Evolution Experiment con E. coli, un modelo clásico de mutaciones con amplios efectos. Tras 15.000 generaciones, los costes en el ambiente selectivo habían disminuido, reflejando mayor robustez mutacional, mientras que los costes pleiotrópicos en otros entornos aumentaron, en concordancia con el compromiso entre robustez y fragilidad predicho por la teoría del control de sistemas.
Finalmente, comparamos los efectos de la resistencia a rifampicina en E. coli, P. mirabilis y S. marcescens. Aunque varios sitios mutacionales se conservaron, las diferencias en uso de codones limitaron la coincidencia aminoacídica. Los efectos sobre aptitud y virulencia fueron escasamente conservados, lo que resalta el papel de la epistasis, del trasfondo genómico y de las interacciones compensatorias en la persistencia de la resistencia a lo largo del tiempo evolutivo.
En conjunto, nuestros resultados muestran cómo la pleiotropía puede moldear trayectorias evolutivas bacterianas de manera tanto predecible como contingente. Estas conclusiones tienen implicaciones amplias para afrontar la resistencia a antibióticos, diseñar terapias informadas por evolución y anticipar respuestas microbianas ante desafíos ambientales. Asimismo, apoyan el potencial de las estrategias antivirulencia como complemento o alternativa a los antibióticos, con capacidad de reducir la gravedad de las infecciones y de minimizar la presión selectiva que alimenta la propagación de la resistencia. Read More
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