En este estudio se aborda la implementación y optimización de la técnica de crioconservación mediante enfriamiento a velocidad controlada en Pinus pinaster. Para poner a punto el protocolo se utilizó el ensayo de tetrazolio (TTC) para determinar la viabilidad celular. Se seleccionaron cinco genotipos basados en su capacidad de proliferación y crecimiento vigoroso. La adecuación del método incluyó la evaluación de la toxicidad de crioprotectores y de la tasa de enfriamiento controlada. Los resultados mostraron que los crioprotectores no disminuyen significativamente la viabilidad celular y que una tasa de enfriamiento de 1 °C/min es crucial para prevenir la formación de cristales de hielo intracelulares y evitar daños coligativos. El tratamiento más eficiente fue el que implicó la eliminación del lavado durante la recuperación y el uso de una caja aislante mejorada para controlar la velocidad de enfriamiento, asegurando que los crioviales con las muestras alcanzaran -40 ºC a una tasa de enfriamiento de 1 °C/min antes de ser transferidos al ultracongelador para su almacenamiento a -150 ºC. La eficiencia máxima fue alcanzada en la línea 4 de las 5 líneas evaluadas, con la que se alcanzó una viabilidad (relativa al control) del 60% después de la crioconservación, confirmando la eficacia del protocolo optimizado. Este protocolo tiene el potencial de contribuir significativamente a la mejora genética y conservación de P. pinaster.
ABSTRACT
In this study, the implementation and optimization of the controlled-rate cooling cryopreservation technique for Pinus pinaster is addressed. The tetrazolium test (TTC) is used to measure cell viability. Five genotypes were selected based on their proliferation capacity and vigorous growth. The suitability of the method included evaluating the toxicity of cryoprotectants and the controlled cooling rates. The results showed that cryoprotectants do not significantly reduce cell viability and that a cooling rate of 1 °C/min is important to prevent the formation of intracellular ice crystal and to avoid colligative damage. The most efficient treatment involved eliminating the washing step during recovery and using an improved insulating box to control the cooling rate, ensuring that the cryovials with samples reached -40 °C at a cooling rate of 1 °C/min before being transferred to the ultrafreezer for storage at -150 °C. Maximum efficiency was achieved in line 4 of the 5 lines evaluated, reaching 60% viability (relative to the control) after cryopreservation, confirming the effectiveness of the optimized protocol. This protocol has the potential to significantly contribute to the genetic improvement and conservation of P. pinaster.
En este estudio se aborda la implementación y optimización de la técnica de crioconservación mediante enfriamiento a velocidad controlada en Pinus pinaster. Para poner a punto el protocolo se utilizó el ensayo de tetrazolio (TTC) para determinar la viabilidad celular. Se seleccionaron cinco genotipos basados en su capacidad de proliferación y crecimiento vigoroso. La adecuación del método incluyó la evaluación de la toxicidad de crioprotectores y de la tasa de enfriamiento controlada. Los resultados mostraron que los crioprotectores no disminuyen significativamente la viabilidad celular y que una tasa de enfriamiento de 1 °C/min es crucial para prevenir la formación de cristales de hielo intracelulares y evitar daños coligativos. El tratamiento más eficiente fue el que implicó la eliminación del lavado durante la recuperación y el uso de una caja aislante mejorada para controlar la velocidad de enfriamiento, asegurando que los crioviales con las muestras alcanzaran -40 ºC a una tasa de enfriamiento de 1 °C/min antes de ser transferidos al ultracongelador para su almacenamiento a -150 ºC. La eficiencia máxima fue alcanzada en la línea 4 de las 5 líneas evaluadas, con la que se alcanzó una viabilidad (relativa al control) del 60% después de la crioconservación, confirmando la eficacia del protocolo optimizado. Este protocolo tiene el potencial de contribuir significativamente a la mejora genética y conservación de P. pinaster.
ABSTRACT
In this study, the implementation and optimization of the controlled-rate cooling cryopreservation technique for Pinus pinaster is addressed. The tetrazolium test (TTC) is used to measure cell viability. Five genotypes were selected based on their proliferation capacity and vigorous growth. The suitability of the method included evaluating the toxicity of cryoprotectants and the controlled cooling rates. The results showed that cryoprotectants do not significantly reduce cell viability and that a cooling rate of 1 °C/min is important to prevent the formation of intracellular ice crystal and to avoid colligative damage. The most efficient treatment involved eliminating the washing step during recovery and using an improved insulating box to control the cooling rate, ensuring that the cryovials with samples reached -40 °C at a cooling rate of 1 °C/min before being transferred to the ultrafreezer for storage at -150 °C. Maximum efficiency was achieved in line 4 of the 5 lines evaluated, reaching 60% viability (relative to the control) after cryopreservation, confirming the effectiveness of the optimized protocol. This protocol has the potential to significantly contribute to the genetic improvement and conservation of P. pinaster. Read More
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