El melanoma es un cáncer cutáneo altamente metastásico cuya incidencia ha aumentado rápidamente en la última década, haciendo crucial la identificación de parámetros de potencial metastásico para la detección temprana de pacientes de alto riesgo. Los macrófagos asociados al tumor (TAMs) juegan un papel clave en la respuesta tumoral y están fuertemente influenciados por el microambiente tumoral (TME). Tradicionalmente, los TAMs se clasificaban en dos fenotipos opuestos, M1 (anti-tumoral) y M2 (pro-tumoral), pero los avances en transcriptómica unicelular han llevado a una clasificación más refinada, propuesta por Ma et al (Ma et al., 2022). Con el objetivo de analizar el TME para identificar parámetros que predigan la metástasis y examinar los fenotipos presentes de TAMs, se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia multicolor y microscopía confocal. La cuantificación de TAMs, neutrófilos y eosinófilos en muestras de tejido de melanoma reveló que los TAMs presentan niveles significativamente más altos de infiltración tumoral, mientras que una mayor infiltración de neutrófilos se asoció con la presencia de metástasis. Además, se detectaron los marcadores proteicos característicos de los diferentes fenotipos de macrófagos, y el análisis de correlación de los niveles de expresión proteica de macrófagos individuales sugirió que todos los fenotipos representan la misma población de macrófagos, que altera dinámicamente su expresión proteica en respuesta al contexto del TME, presentando fenotipos superpuestos e intermedios.
Además de la caracterización de los macrófagos, un entendimiento profundo de las interacciones entre las células de melanoma y los TAMs es esencial para el desarrollo de terapias dirigidas al remodelado del TME. Con el objetivo de evaluar el papel de los macrófagos en la invasión tumoral y la muerte celular tumoral, esferoides de melanoma fueron sometidos a un ensayo de invasión 3D in vitro y a un ensayo 3D de muerte celular, desarrollado en este proyecto. El ensayo de invasión 3D demostró que los macrófagos M1 y las células de melanoma influyen mutuamente en sus fenotipos, secretando mediadores que promueven la migración celular tumoral. Además, el ensayo de muerte celular sugirió que los macrófagos M1 podrían inducir de manera independiente la muerte de células de melanoma y/o inhibir su proliferación, mientras que los macrófagos M2 probablemente promuevan la proliferación, incrementando el tamaño del esferoide tumoral.
La plasticidad de los TAMs, demostrada repetidamente a lo largo de este proyecto, resalta el potencial de las terapias dirigidas al remodelado del TME para modular la diferenciación de los macrófagos y la progresión tumoral. Si bien los avances recientes en la caracterización funcional de los macrófagos son esenciales para lograr este objetivo, se requiere más investigación para comprender completamente los mecanismos mediante los cuales las células tumorales y los TAMs interactúan y responden a la modulación de los estímulos del TME.
ABSTRACT
Melanoma is a highly metastatic skin cancer whose incidence has rapidly increased over the last decade, making it vital to identify metastatic potential parameters for early detection of high-risk patients. Tumour-associated macrophages (TAMs) play a pivotal role in tumour response and are strongly influenced by the tumour microenvironment (TME). TAMs were traditionally classified into M1 (anti-tumoral) and M2 (pro-tumoral) phenotypes but advances in single-cell transcriptomics have led to a more refined classification, proposed by Ma et al (Ma et al.,2022). With the aim of analysing the TME to identify parameters that predict metastasis and examine the present TAM phenotypes, multicolour immunofluorescence and confocal microscopy were used. TAM, neutrophil, and eosinophil quantification in melanoma tissue samples revealed that TAMs exhibit significantly higher tumour infiltration levels, while elevated neutrophil infiltration was associated with the occurrence of metastasis. In addition, the protein markers characteristic of different macrophage phenotypes were detected, and correlation analysis of single-macrophage protein expression levels suggested that all phenotypes represent the same macrophage population, which dynamically alters its protein expression in response to the TME context, presenting overlapping and intermediate phenotypes.
As well as macrophage phenotyping, a thorough understanding of the interactions between melanoma cells and TAMs is essential for the development of therapies aimed at remodelling the TME. With the objective of assessing the roles macrophages play in tumour invasion and tumour cell death, melanoma spheroids were subjected to a 3D in vitro invasion assay and a newly developed 3D spheroid-based killing assay. The 3D invasion assay demonstrated that M1 macrophages and melanoma cells mutually influence each other’s phenotype, secreting mediators that promote tumour cell migration. Additionally, the 3D killing assay suggested that M1 macrophages may independently induce melanoma cell death and/or inhibit its proliferation, while M2 macrophages likely promote proliferation, increasing tumour spheroid size.
The plasticity of TAMs, demonstrated repeatedly throughout this project, highlights the potential of therapies targeting TME remodelling to modulate macrophage differentiation and tumour progression. While recent advances in the functional characterization of macrophages are essential for achieving this goal, further research is required to fully understand the mechanisms through which tumour cells and TAMs interact and respond to TME stimuli modulation.
El melanoma es un cáncer cutáneo altamente metastásico cuya incidencia ha aumentado rápidamente en la última década, haciendo crucial la identificación de parámetros de potencial metastásico para la detección temprana de pacientes de alto riesgo. Los macrófagos asociados al tumor (TAMs) juegan un papel clave en la respuesta tumoral y están fuertemente influenciados por el microambiente tumoral (TME). Tradicionalmente, los TAMs se clasificaban en dos fenotipos opuestos, M1 (anti-tumoral) y M2 (pro-tumoral), pero los avances en transcriptómica unicelular han llevado a una clasificación más refinada, propuesta por Ma et al (Ma et al., 2022). Con el objetivo de analizar el TME para identificar parámetros que predigan la metástasis y examinar los fenotipos presentes de TAMs, se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia multicolor y microscopía confocal. La cuantificación de TAMs, neutrófilos y eosinófilos en muestras de tejido de melanoma reveló que los TAMs presentan niveles significativamente más altos de infiltración tumoral, mientras que una mayor infiltración de neutrófilos se asoció con la presencia de metástasis. Además, se detectaron los marcadores proteicos característicos de los diferentes fenotipos de macrófagos, y el análisis de correlación de los niveles de expresión proteica de macrófagos individuales sugirió que todos los fenotipos representan la misma población de macrófagos, que altera dinámicamente su expresión proteica en respuesta al contexto del TME, presentando fenotipos superpuestos e intermedios.
Además de la caracterización de los macrófagos, un entendimiento profundo de las interacciones entre las células de melanoma y los TAMs es esencial para el desarrollo de terapias dirigidas al remodelado del TME. Con el objetivo de evaluar el papel de los macrófagos en la invasión tumoral y la muerte celular tumoral, esferoides de melanoma fueron sometidos a un ensayo de invasión 3D in vitro y a un ensayo 3D de muerte celular, desarrollado en este proyecto. El ensayo de invasión 3D demostró que los macrófagos M1 y las células de melanoma influyen mutuamente en sus fenotipos, secretando mediadores que promueven la migración celular tumoral. Además, el ensayo de muerte celular sugirió que los macrófagos M1 podrían inducir de manera independiente la muerte de células de melanoma y/o inhibir su proliferación, mientras que los macrófagos M2 probablemente promuevan la proliferación, incrementando el tamaño del esferoide tumoral.
La plasticidad de los TAMs, demostrada repetidamente a lo largo de este proyecto, resalta el potencial de las terapias dirigidas al remodelado del TME para modular la diferenciación de los macrófagos y la progresión tumoral. Si bien los avances recientes en la caracterización funcional de los macrófagos son esenciales para lograr este objetivo, se requiere más investigación para comprender completamente los mecanismos mediante los cuales las células tumorales y los TAMs interactúan y responden a la modulación de los estímulos del TME.
ABSTRACT
Melanoma is a highly metastatic skin cancer whose incidence has rapidly increased over the last decade, making it vital to identify metastatic potential parameters for early detection of high-risk patients. Tumour-associated macrophages (TAMs) play a pivotal role in tumour response and are strongly influenced by the tumour microenvironment (TME). TAMs were traditionally classified into M1 (anti-tumoral) and M2 (pro-tumoral) phenotypes but advances in single-cell transcriptomics have led to a more refined classification, proposed by Ma et al (Ma et al.,2022). With the aim of analysing the TME to identify parameters that predict metastasis and examine the present TAM phenotypes, multicolour immunofluorescence and confocal microscopy were used. TAM, neutrophil, and eosinophil quantification in melanoma tissue samples revealed that TAMs exhibit significantly higher tumour infiltration levels, while elevated neutrophil infiltration was associated with the occurrence of metastasis. In addition, the protein markers characteristic of different macrophage phenotypes were detected, and correlation analysis of single-macrophage protein expression levels suggested that all phenotypes represent the same macrophage population, which dynamically alters its protein expression in response to the TME context, presenting overlapping and intermediate phenotypes.
As well as macrophage phenotyping, a thorough understanding of the interactions between melanoma cells and TAMs is essential for the development of therapies aimed at remodelling the TME. With the objective of assessing the roles macrophages play in tumour invasion and tumour cell death, melanoma spheroids were subjected to a 3D in vitro invasion assay and a newly developed 3D spheroid-based killing assay. The 3D invasion assay demonstrated that M1 macrophages and melanoma cells mutually influence each other’s phenotype, secreting mediators that promote tumour cell migration. Additionally, the 3D killing assay suggested that M1 macrophages may independently induce melanoma cell death and/or inhibit its proliferation, while M2 macrophages likely promote proliferation, increasing tumour spheroid size.
The plasticity of TAMs, demonstrated repeatedly throughout this project, highlights the potential of therapies targeting TME remodelling to modulate macrophage differentiation and tumour progression. While recent advances in the functional characterization of macrophages are essential for achieving this goal, further research is required to fully understand the mechanisms through which tumour cells and TAMs interact and respond to TME stimuli modulation. Read More
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